血液段階におけるインビボ培養とインビトロ培養の間のバベシア・ギブソニ（武漢分離株）の転写変動

寄生虫とベクター 16 巻、記事番号: 268 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

犬バベシア症の原因物質であるバベシア ギブソニは、アピコンプレックス門に属します。 インビトロ培養技術の発展により、マラリア原虫属のトランスクリプトーム解析を含む、さまざまな種類のオミクス研究における研究の進歩が推進されました。 これにより、診断用抗原の観察とワクチン開発が促進されました。 それにもかかわらず、バベシア属に関する情報はありません。 この点で、血液段階での寄生虫の成長と発達のさらなる理解を大きく妨げる可能性があります。

この研究では、in vitro で連続培養された B. gibsoni (武漢分離株) の形態と感染力のかなりの変化が、in vivo の寄生虫と比較して観察されました。 これらの変化に基づいて、B. gibsoni (武漢分離株) を in vivo および in vitro 培養の両方から収集し、続いて全 RNA 抽出と Illumina トランスクリプトーム配列決定を行いました。 取得された差次的発現遺伝子 (DEG) は、qRT-PCR を使用して検証され、いくつかのデータベースを通じて機能的に注釈が付けられました。 インビトロ培養後に最大の上方制御を示す遺伝子は、B. gibsoni (武漢分離株) のゲノムからクローン化され、ネイティブ型と細胞局在を検出するためのウェスタンブロッティングと間接免疫蛍光アッセイによって特徴付けられました。

実験室での培養を通じて、複数の形態の寄生虫が観察され、体外で培養された犬の寄生虫の感染力が低いことが判明しました。 これらの変化に基づいて、イルミナのトランスクリプトーム配列決定が実施され、377 個のユニジーンが上方制御され、334 個のユニジーンが下方制御されていることが示されました。 特に、寄生虫のすべての発生段階に必須である AP2 転写因子ファミリーがスクリーニングされ、これらのファミリー メンバーの転写変化がテストされました。 したがって、インビトロ適応後に最も高い上方制御された発現を有する新規なＡＰ２転写因子遺伝子（ＢｇＡＰ２－Ｍ）が選択された。 この遺伝子は、662 アミノ酸の全長タンパク質をコードする 1989 塩基対のオープン リーディング フレーム (ORF) で構成されています。 BgAP2-M には 1 つの AP2 ドメインと 1 つの ACDC 保存ドメインが含まれており、これらは寄生虫の核生物学に関与している可能性があります。 BgAP2-M ペプチドに対して調製されたポリクローナル抗体は、約 73 kDa のネイティブ サイズをさらに検出し、B. gibsoni の核に局在化しました。

この研究は、B. gibsoni の in vivo および in vitro での徹底的なトランスクリプトーム解析を初めて提示し、血液段階における寄生虫の成長と発達に対する環境変化の影響の詳細な理解に貢献します。 さらに、バベシア属のさまざまなライフステージ調節因子としての ApiAP2 転写因子ファミリーのさまざまなメンバーについてのより深い研究も提供します。

バベシア種は、分類学的にアピコンプレックス門、ピロプラズマ綱、ピロプラスミダ目、およびババシ科に分類される偏性赤血球内ヘモプロトゾールである[1、2、3]。 バベシア ギブソニは、溶血性貧血、ヘモグロビン尿症、低血圧性ショック、死亡などの典型的な犬バベシア症の症状を引き起こす血液原虫寄生虫です [4,5,6]。 この生物は、丘陵地帯の原野に広く分布する Haemaphysalis longicornis によっても経卵巣的に伝染します [7、8、9、10]。

実験室の in vitro 培養システムは、バベシア ボビス、B. ビゲミナ、B. ギブソニ、B. オリエンタリス、熱帯熱マラリア原虫、および P. knowlesi を含むさまざまなアピコンプレクサ寄生虫に対して確立されています [11、12、13、14、15]。 物理的、栄養的、免疫学的要因など、生体内とは異なるいくつかの in vitro 環境要因により、寄生虫は形態、感染力、病原性において目に見える意味のある変化を示す傾向があります。 例えば、B. gibsoni 大分分離株では、長期間の in vitro 培養により、宿主赤血球内に大型で多数の寄生虫が形成され、イヌでは寄生虫の感染力が低下しました [13、16]。 したがって、より深い転写変化は誘発的かつ重要であると考えられます。 しかし、インビトロ培養によって影響を受ける遺伝子のそのような変化は、熱帯熱マラリア原虫と熱帯熱マラリア原虫の両方で研究されている[17、18、19、20]。 このような変化は、寄生虫が周囲の環境に適応していることを示し、より良い生存と繁殖をもたらす場合があります [21]。 例えば、一部の有性期遺伝子（配偶子抗原 27/25）や、無性期の侵入と成長に関連するその他の遺伝子（MSP7、DOC2、CLAMP）は、伝達される可能性がはるかに低いため、比較的大きな転写変異があることが確認されています。新しい蚊媒介物質に感染し、インビトロ環境では宿主赤血球に侵入する可能性が高くなります[17、19]。 注目すべきことに、さまざまな ApiAP2 転写因子もある程度の転写変化を起こしました。 このタンパク質ファミリーは 1 ～ 3 つの DNA 結合ドメインを持ち、アピコンプレックス類の生物において最大の転写因子ファミリーであることが判明しており、寄生虫のすべての発生段階を正確に制御しています [22、23]。 熱帯熱マラリア原虫では、2 つの AP2 転写因子、PF3D7_1222600 (PfAP2-G) および PF3D7_1222400 (PfAP2-G4) が、中途終止コドンを持つ機能喪失型ナンセンス変異を有し、配偶子細胞形成中の遺伝子転写の大幅な抑制につながることが十分に文書化されています。 。 別の AP2 転写因子 (PF3D7_1342900、PfAP2-HS) には 3 つのナンセンス変異が検出され、そのすべてが予測された AP2 ドメインの上流に存在し、全長タンパク質が切断されていました。 PfAP2-HS における転写に影響を与えるこれらの変異は、おそらく in vitro 環境における温度変動に対する耐性の向上に起因すると考えられます [18]。 さらに、最近の研究では、無性生殖に関与している可能性がある機能不明の AP2 遺伝子 (PF3D7_0420300) の転写レベルの増加が観察されています [19]。